УДК 577.151

ББК 28.072

Д 31

Демченко Ю.А.

ФГБОУ ВО «Адыгейский государственный университет»

 

ЛИПАЗА: СВОЙСТВА, ИСТОЧНИКИ, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ

 

Аннотация. Представлен анализ отечественной и зарубежной литературы в области современных представлений об особенностях строения, функционирования, получения и использования липазы разного происхождения в различных областях промышленности.

Ключевые слова: липаза, триацилглицеролацилгидролаза, активность фермента, ингибирование, триглицериды.

Demchenko Yu.A.

Adyghe State University

 

LIPASE: SOURCES, METHODS OF OBTAINING, APPLICATION

 

Abstract. The analysis of domestic and foreign literature in the field of modern ideas of features of the building, functioning, receiving and use of a lipase of different origin in various fields of the industry is submitted.

Keywords: lipase, triatsilglitserolatsilgidrolase, activity of enzyme, inhibition, triglycerides.

Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции, которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом [16]. Создание промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов помогает существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии или даже создать принципиально новые высокоэффективные процессы [16, 22]. Все это свидетельствует о том, что производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии, которое будет и далее интенсивно развиваться, и расширяться.

В этой связи большой интерес для многих отраслей народного хозяйства, где необходим частичный или полный гидролиз жиров и масел представляют липазы. Они находят применение в пищевой и легкой промышленности, сельском хозяйстве, медицине, в бытовой химии, коммунальном хозяйстве и в аналитической практике.

Целью работы явилось изучение современных представлений о механизмах функционирования, способах получения и применения в промышленности липаз различного происхождения.

Липолитические ферменты (липазы) — группа ферментов, катализирующие реакции гидролитического расщепления жиров с образованием моно- и диглицеридов и свободных жирных кислот, при этом наибольшее сродство фермент проявляет к эфирным связям, расположенным на внешней части молекулы триглицерида [25].

По классификации ферментов липазы относятся к эстеразам (класс гидролаз). Фермент водорастворимый, который катализирует гидролиз нерастворимых эстеров – липидных субстратов, помогая переваривать, растворять и фракционировать жиры. По номенклатуре ферментов липаза имеет название триацилглицеролацилгидролаза (КФ 3.1.1.3), ее рекомендуемое рабочее название — триацилглицероллипаза; фермент имеет еще названия: стеапсин, трибутираза, липаза триглицеридов.

Характерной особенностью гидролитических ферментов, в том числе липаз, можно назвать уникальные физико-химические условия катализируемых ими реакций [1, 4, 18, 19]. Процесс катализа происходит на поверхности раздела фаз, фермент катализирует расщепление эфиров ненасыщенных и насыщенных алифатических кислот, с не менее чем 12 атомами углерода в цепи и способен катализировать не только гидролиз, но и обратные реакции трансэтерификации, этерификации, ацидолиза и алкоголиза [22] (рисунок 1).

  

Рисунок 1 Схема гидролиза и синтеза триацилглицерола (по Е.С. Северину)

 Установлено [19], что чем выше степень деспергирования субстрата, тем быстрее идет липолиз. Вероятно, это связано с явлением сорбции фермента на поверхности субстрата. Считается, что именно этот процесс является первым актом ферментативного липолиза. От гомогенности субстрата напрямую зависит скорость липолиза, что многие авторы связывают с явлением абсорбции фермента на поверхности субстрата [13]. Полный гидролиз осуществляется тремя липазами (рисунок 2).

Рисунок. 2 Действие липазы на субстрат (по Е.С. Северину)

 Как видно из рисунка, первая - расщепляет 1,3-связи – триацилглицерола (ТАГ), затем вступает в действие диацилглицероллипаза и последней - моноацилглицероллипаза, катализирующая гидролиз сложноэфирной связи в моноацилглицеролах. Активация липазы происходит только на поверхности гидрофобного метасубстрата [17, 27]. Конформация фермента изменяется в процессе связывания с этим субстратом, и полипептидный участок, сдвигаясь в сторону, открывает доступ молекулам субстрата к активному центру [7, 17].

По мнению ряда авторов, [5, 16, 41, 42], активный центр липаз можно разделить на три участка, имеющих функциональные различия: первый — контактный, ответственный за идентификацию поверхности субстратной фазы; второй – гидрофобный связывающий участок, осуществляющий извлечение одной молекулы субстрата из субстратной фазы в глобулу фермента; третий – образованный группами, инициирующий каталитический акт гидролиза сложноэфирной связи [5, 43] (рисунок 3).

 

Рисунок 3. Схема организации активного центра липаз (по данным М. Рахимова, 1981г.)

Структура липазы, объясняющая поведение фермента на границе раздела фаз липид - вода, оставалась неразгаданной многие годы. И только в 1990 г. с помощью рентгено-структурного анализа были получены первые структуры, открывшие уникальный механизм действия липаз, отличающих их от многих других ферментов. Было установлено, что поверхностная активация фермента осуществляется благодаря наличию у липазы амфифильной петли [17-19], образованной CC-спиралью аминокислотной последовательности, прикрывающей активный центр фермента в отсутствие поверхности раздела фаз, и, следовательно, препятствующей доступу субстрата к каталитическому центру фермента. В результате контакта фермента с поверхностью раздела липид-вода происходит конформационное изменение структуры липазы, заключающееся в смещении петли, напоминающем открытие крышки [37, 38]. Изменение положения «петли-крышки» открывает активный центр и большую гидрофобную поверхность фермента, отвечающую за связывание липазы с гидрофобным субстратом [12].

 Липаза также, способна гидролизовать как природные, так и синтетические субстраты с различной структурой [15, 16]. Некоторые авторы [11, 12, 13] в качестве особенностей липазы выделяют ее поверхностную активацию, т.е. резкое увеличение активации при концентрации субстрата, превышающей предел ее растворимости. Липазы катализируют гидролиз, синтез, трансэтерификацию эфиров.

 Установлено, что большинство липолитических ферментов в своем активном центре содержат сериновую триаду Ser-Gis-Asp (рисунок 4).

 

Рисунок 4. Модель молекулы растительной липазы [35]

Некоторые авторы (Canaan S. et al.,1999 и Gargouri Y. et al.,1989) отмечают участие сульфгидрильных групп в акте катализа, однако единого мнения об их расположении в молекуле нет: находятся SH-группы в составе активного центра или вблизи него, в участке ответственном за гидрофобное связывание фермента с поверхностью раздела [28, 32]. В настоящее время определено, что нуклеофильная атака на карбонильный углерод эфирной связи осуществляется остатком серина, активизированным через сеть водородных связей с имидазольной группой гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислотами [20, 21]. В работе Трофимовой О.Д. отмечено, что в активных центрах гидролитических ферментов -COOH группы могут служить местом прикрепления к субстрату или вызывая электронные смещения путем образования водородных связей, или осуществлять кислотно-основный катализ, оказывая влияние на полярность связей соседних с ними групп фермент-субстратного комплекса [2, 3, 8].

Источники получения липазы. Липолитические ферменты могут быть получены из трех источников: животных тканей, семян некоторых растений и микроорганизмов. Источником животной липазы является поджелудочная железа. Она может быть выделена в комплексе с другими панкреатическими ферментами или в свободном виде. Обычно она используется исключительно в медицинских целях. В заметных количествах липаза содержится в семенах многих растений: пшеницы, ржи, овса, сои, хлопчатника, клещевины. Причем отличительной ее особенностью будет нерастворимость в воде. Растительные липазы достаточно глубоко изучены, но не с позиции получения, а с точки зрения ее влияния на сроки хранения и процессы прорастания семян.

Липазы различного происхождения проявляют сродство к определенным кислотным остаткам. Так, панкреатическая липаза обладает высокой специфичностью к расщеплению связи с участием остатка олеиновой кислоты, а связи, образованные пальмитиновой кислотой, гидролизуются значительно медленнее. Известно, что липазы быстрее отщепляют остатки высокомолекулярных жирных кислот, чем низшие карбоновые кислоты, т.е. нерастворимые в воде субстраты. Водорастворимые субстраты. Для выяснения механизма каталитического действия липолитических ферментов, можно проводить исследования с водорастворимыми субстратами [41]. Липазы способны гидролизовать водорастворимые субстраты (таблица1).

Таблица 1 Влияние вида липидного компонента на биосинтез липазы культурой R. oryzae 14-14 [26, 27,30]

Панкреатическая липаза атакует растворенный триацетин и трипропионин, хотя в этом случае существует корреляция между скоростью реакции и образованием мицелл [33]. Наиболее перспективным источником липаз являются микроорганизмы, так как животное и растительное сырье не может удовлетворить растущую потребность в липолитических препаратах. Бактерии, как правило, накапливают внутриклеточную липазу, а актиномицеты, грибы и дрожжи - преимущественно внеклеточную. Жирнокислотный состав ТАГ-субстрата также влияет на скорость гидролиза, так у клещевины ТАГ-липаза быстрее отщепляет остатки ненасыщенных жирных кислот, чем насыщенных. Отмечается, что вместе со старением семян подсолнечника идет накопление свободных жирных кислот и уменьшение содержания триацилглицеролов [8, 16]. В зародышах семян, утративших жизнеспособность, липазная активность может снижаться в несколько раз, однако полной ее инактивации не происходит, предполагается, что в «мертвых» семенах способны продолжать накапливаться свободные жирные кислоты. Известно, что липаза проявляет низкую активность по отношению к мономерным субстратам, напротив, в присутствии агрегатов молекул, так называемых суперсубстратов (капель жира), активность фермента значительно   увеличивается [14]. Свойство поверхностной активации отличает липазу от обычных эстераз, действующих на водорастворимые субстраты.

Оптимум действия большинства липаз, за некоторыми исключениями лежит в области рН от 8 до 9. Липаза из клещевины наиболее активна при рН 4,2, у тканевых липаз липосомного происхождения оптимум рН ниже 5, а липазы из микроорганизма Мисог pusillusпроявляют максимальную активность в области рН от 5 до 6.  Липолитические ферменты могут действовать в очень широком диапазоне температур; например, некоторые липазы микроорганизмов активны при - 20°С [9, 42], а фермент из семян Vernonia anthelminthica - при 65°С. Для обнаружения активности многих липолитических ферментов требуются продолжительные периоды инкубации. Например, используя 30 мг фирменного препарата неочищенной панкреатической липазы свиньи, за 5-15 мин можно прогидролизовать в 200 мг очищенного оливкового масла 30-50% сложноэфирных связей с первичными гидроксильными группами глицерина. Однако этот препарат представляется собой сконцентрированный источник липаз, а большинство тканевых экстрактов обладает гораздо более низкой активностью. Инкубация продолжительностью более 15 мин приводит к ацильной миграции в 1,2(2,3) - диглицеридах и 2-моноглицеридах, являющихся наиболее вероятными продуктами липолиза, с образованием из них 1,3- и 1-изомеров[14]. Так как скорость липолиза является функцией концентрации субстрата, т.е. зависит от площади поверхности, доступной действию фермента, важно, чтобы субстрат был получен в виде максимально тонкой эмульсии [42]. Встряхивание, перемешивание и даже воздействие ультразвуком, которое очень эффективно для диспергирования, образуются нестабильные эмульсии. Для получения стабильных эмульсий необходимо добавлять эмульгаторы. Обычно с этой целью используют гуммиарабик (из акации) в концентрации 2-10%, применяют также и поливиниловый спирт, и метилированную целлюлозу.  Хлористый натрий активирует липолиз нерастворимых триглицеридов с длинной и короткой цепью, а также гидролиз растворимых триглицеридов с короткой цепью. Обнаруживаемые скорости ферментативного гидролиза триолеина, трибутирина, триацетина, оливкового масла все без исключения возрастают при добавлении соли. В случае триглицеридов с длинной цепью, таких, как триолеин, обнаруживаемое стимулирование панкреатического липолиза в значительной степени обусловлено наличием специфических компонентов реакционной смеси.

Для получения комплексов из поджелудочной железы свиньи готовят растворы липазы и полистиролсульфоната-Na (ПСС) с концентрациями 10-5 М, затем смешивают растворы липазы и ПСС в различных соотношениях от 100:1 до 1:100. Полученный раствор пропускают через фильтр с размером пор 450 нм. Далее из коэффициента диффузии рассчитывается диаметр наночастиц. Все измерения в данном исследовании проводят при температуре 25 C. В анализаторе Nano ZS используется гелий-неоновый (He–Ne) лазер мощностью 4 мВт, работающий при длине волны 633 нм. 

В семенах масличных культур различают нерастворимую и растворимую формы липазы. Нерастворимая – характерна для семян клещевины, а растворимая обнаруживается в семенах злаковых и большинства масличных культур. Для семян подсолнечника характерна липаза, имеющая разные оптимумы действия в диапазоне рН 4,5-8,5 [26]. У покоящихся семян клещевины наибольшая активность фермента наблюдается при рН 4,5-5,0, у сои – рН=5, прорастающие семена имеют рН оптимум близкий к нейтральному. Изменение кислотного числа неразрывно связанно с липазой, активность и специфика действия которой имеет особую важность в процессе сбора, хранения и переработки семян масличных культур [18]. Основными факторами внешней среды, определяющими активность фермента, являются условия и срок хранения семян, влажность, температура, газовая среда, а также воздействия химического и биологического происхождения. Липаза сухих семян масличных культур устойчива к действию температур более 35ºС, тогда как во влажных условиях – быстро инактивируется. В работах [] отмечается, что при влажности 12 % семена могут храниться с незначительным увеличением активности липаз, при этом подсолнечник с влажностью на уровне 8-12 % может храниться не более 6-10 месяцев [18, 19], а при влажности ниже 7-7,5% или в этом пределе в семенах сохраняется синтетическая направленность биохимических процессов. На биохимические процессы в семенах масличных культур влияет температура. В первую очередь, они характеризуются изменением кислотного числа, которое в свою очередь находятся в пропорциональной зависимости от влажности семян и времени действия температуры [4]. На активность липазы могут влиять такие морфофизиологические показатели как размер и степень зрелости семян [1]. Наивысший уровень активности – у мелких семян хлопчатника, среди которых большое число незрелых, а наименьший -  характерен для крупных семян [14]. Необходимо учитывать и возрастные особенности в изменении активности энзима: так в покоящихся семенах, находящихся на хранении, активность на треть меньше, чем в проростках.

Среди бактерий найдены активные продуценты липаз, относящиеся к родам Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter, Propionibacterium[32, 41], Chromobacterium, Alcaligenes. Среди дрожжей лучшими продуцентами являются представители рода Candida (С. lipolytica, С. rugosa, С. paralipolytica, С. cylindraceae). Для промышленного использования чаще всего рекомендуются микроскопические грибы. Высокая липолитическая активность отмечается у грибов рода: Geotrichum, Aspergillus, Мисог, Rhizopus, Prnicillium, Oosporaи Humicola. Продуценты липаз найдены и среди актиномицетов, среди которых можно назвать виды Streptomycesflavogriseus, Thermoa ctinomycesvulgaris. Среди бактерий активные продуценты липаз относятся к родам Bacillus, Acinetobacter, Propionibacterium, Chromobacterium, Alkaligenes. Среди дрожжей лучшими продуцентами являются представители рода Candida (C. lipolytica, C. paralipolytica, C. cylindraceae). Высокая липазная активность отмечается у грибов родов Geoteichum, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Penicillium, Oospora Humicola.

Известен способ получения липазы, предусматривающий культивирование ее продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и его очисткой. Однако время культивирования этого продуцента, а также других известных продуцентов не менее 5 б ч. Это приводит к тому, что в культуральной жидкости, примерно с конца вторых суток, идет накопление наряду с липазами и протеаз, которые снижают со временем липазную активность. Для уменьшения влияния протеаз в культуральную жидкость вводят стабилизаторы. Все это ведет к усложнению и удорожанию ферментационных процессов.

Получение препаратов липаз и их очистка проводятся из фильтратов культуральной жидкости. Биомасса продуцента отделяется центрифугированием или фильтрованием. Жидкая фаза культуры стабилизируется солями и концентрируется ультрафильтрацией или вакуум-выпариванием. Полученный концентрат может непосредственно высушиваться для получения технических препаратов (Г3х). Однако чаще проводят выделение фермента осаждением органическими растворителями или сульфатом аммония. Для получения высокоочищенных препаратов липаз широко используют все методы хроматографии, электрофорез, гель-фильтрацию и изофокусирование.

Применение в промышленности. В последнее время значительную долю рынка промышленных ферментов (около 70 %) составляют гидролазы, включающие липазы, применяющиеся в процессах переэтерификации жиров, органическом синтезе, для разделения рацемических смесей и получения ароматических добавок. Наибольшие успехи достигнуты в применении липаз в составе биокатализаторов для переэтерификации жиров, получения биотоплива и в качестве добавок к поверхностно-активным веществам [1]. Наиболее востребованы липазы грибов и бактерий, принадлежащих к экстремофильным микроорганизмам (таблица 2)

Таблица 2 Промышленное использование микробиальных липаз [8]

Пищевая промышленность. Использование липаз в пищевой промышленности включает четыре основных направления: 1) улучшение пластичности масла; 2) получение аналогов масла какао; 3) повышение пищевой ценности триглицеридов; 4) получение сыров. Первые из трех направлений основаны на переэтерификации природных триглицеридов, катализируемой специфичными липазами.  Получение жиров с улучшенной пластичностью Пластичность маргарина, получаемого гидрогенизацией ненасыщенных триглицеридов растительных масел, зависит от степени ненасыщенности получаемого продукта. В то же время, гидрогенизация растительного масла может приводить к формированию нежелательных транс-изомеров ненасыщенных жирных кислот, вредных для здоровья человека [17]. В связи с этим, желаемую пластичность масел можно получить переэтерификацией соответствующей смеси насыщенных и ненасыщенных триглицеридов, катализируемой 1,3-специфичными липазами и неспецифическими липазами [35].  Получение аналогов масла какао, температура плавления которых близка температуре тела человека, их используют в производстве шоколада и суппозитарных основ медицинских препаратов.

Многие триглицериды, входящие в состав детского питания, производятся переэтерификацией триглицеридов с использованием специфичных липаз [32].  Прием пищевых триглицеридов, содержащих ненасыщенную жирную кислоту, например, эйкозатстраеновую или декозагексаеновую кислоту, предотвращает развитие сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний. Некоторые триглицериды этого типа производят переэтерификацией триглицеридов рыбьего жира, катализируемой специфичными липазами [32, 33], которая в отличие от химического метода не приводит к образованию продуктов побочного окисления ненасыщенных жирных кислот.

Пищевая промышленность. Хлебопечение. В хлебопечении препараты липазы начали использовать намного позднее, чем другие. В пшеничной муке субстратом для действия липаз являются собственные липиды муки, содержание которых может достигать до 2…3 % от ее массы, а также жировые продукты, присутствующие в рецептуре [15]. Установлено, что применение препаратов липазы приводит к улучшению реологических свойств теста, увеличению удельного объема изделий, улучшению структуры и цвета мякиша. Также есть сведения, что липазы способствуют замедлению черствения хлеба, что можно объяснить действием продуктов гидролиза - моноглицеридов и жирных кислот, которые, образуя комплексы с амилозой, замедляют ее ретроградацию [8, 18]. Однако ввиду крайне незначительного содержания липидов в муке и, соответственно, количества образующихся поверхностно-активных веществ, есть основания полагать, что происходит модификация не только крахмальной, но и белковой составляющей муки. Предполагается, что липазы изменяют взаимодействия между белками и липидами муки, улучшая качество клейковины [19].

Кроме того, липолитические ферменты косвенно влияют на окислительные процессы в тесте при замесе, что происходит за счет увеличения доступности ненасыщенных жирных кислот для действия фермента липоксигеназы, присутствующего в муке или введенного в тесто в составе улучшителей. Фермент липоксигеназа катализирует свободнорадикальное окисление ненасыщенных жирных кислот с образованием в качестве промежуточных соединений свободных радикалов, а также неустойчивых в сложной биологической среде гидропероксидов стадия 2 [6]. Эти вещества участвуют в реакциях окисления сульфгидрильных (-SH) групп с образованием дополнительных дисульфидных (-S-S-) связей в белковых цепях (стадия 3), в результате чего происходит улучшение реологических свойств клейковины [1, 20].

Получение сыров. Сычужная «паста», выделяемая из желудка жвачных животных, представляет собой смесь ферментов, используемых в производстве сыров. Ее активными компонентами являются эстеразы, липазы, химозин и протеазы.

 Применение липаз разной субстратной специфичности позволяет получать различные вкусовые свойства сыров, в том числе и его аромат, а также ускорять созревание сыра [17]. Применение липаз е хлебопекарной промышленности Ферментные препараты липаз в больших объемах применяют сегодня в мукомольной и хлебопекарной промышленности.

 Получение моноглицеридов Ферментативный метод получения моноглицеридов, используемых в качестве природных эмульгаторов в производстве пищевых продуктов, косметических средств и лекарственных препаратов, включает либо катализируемый специфичными липазами гидролиз триглицеридов, либо этерификацию глицерина жирными кислотами, эфирами жирных кислот и триглицеридами [23].

 Производство моющих средств. Использование липаз в составе стиральных порошков и моющих средств, позволяет удалять жировые пятна без деструкции тканей и использовать умеренные температуры стирки [23], Компания Novo-Nordisk является первой компанией, получившей для этих целей препарат Lipolase (рекомбинантную грибную липазу из Humicola lanuginose, экспрессированную в Aspergillus oryzae) [23]. Бумажное производство Компания Nihon Seishi Со. (Япония) разработала метод обезжиривания сырьевой древесины с использованием липаз [14], что оказалось намного эффективнее скипидарного метода, используемого теперь лишь в производстве бумаги низкого качества. 

Текстильное производство. Обработка ткани липазой приводит к повышению водопоглощения текстильных материалов, и их капиллярность после обработки составляет более 120 мм. Этот эффект обусловлен способностью липаз катализировать реакцию гидролитической деструкции воскообразных веществ, придающих суровой ткани свойство несмачиваемости. В отличие от процессов омыления воскообразных веществ в присутствии щелочного агента деструкция восков под действием липаз проходит при температурах от 40 до 60°С. При обработке композицией ферментов дополнительный эффект гидрофилизации ткани обеспечивается активностью оксидаз за счет ступенчатого окисления предельных жирных кислот [27].

Медицина.  В настоящее время, одно из важнейших направлений использования липаз для нужд человека представляю различные области медицины, включающие терапию заболеваний пищеварительного тракта, лечение от избыточного веса, диагностику многих болезней, а также получение хорошо усваиваемых диетических триглицеридов. Для облегчения усваиваемости пищевых жиров люди, страдающие панкреатической недостаточностью, проходят заместительную терапию, заключающуюся в употреблении панкреатического препарата с каждым приемом пищи [39]. Недостатком этого метода является частичная деструкция липаз панкреатического препарата протеазами пищеварительной системы человека и частичная инактивация липаз в условиях кислой среды желудка. В настоящее время препарат для лечения панкреатических заболеваний содержит различные липазы, включая рекомбинантную желудочную липазу человека, специфичность которой к длинно- и короткоцепочечным триглицеридам намного выше, чем у нативного фермента [42], что сильно увеличивает усваеваемость липидов в организме человека. Использование панкреатических препаратов, содержащих наряду с панкреатической липазой свиньи бактериальные липазы, устойчивые к кислым значениям рН [1], способствует увеличению веса.  Традиционное лечение ожирения главным образом основано на контролировании усваеваемости жиров путем обратимого ингибирования пищеварительных липаз. На сегодняшний день известен ряд ингибиторов липолитическои активности: пропроналол, тиазопонин, производные борной кислоты и т.д [4, 5]. Одним из эффективных средств, нивелирующим действие желудочной липазы, холестеролгидролазы и панкреатической липазы человека путем образования неактивного ацилфермента и подавления секреции панкреатической липазы в поджелудочной железе, является тетрагидролипстатин (THL) из Streptomycestoxytricini [6].

Органический синтез. Одним из примеров использования липаз в органическом синтезе является получение ацилированных гликозидов [22, 23], эмульгаторов, проявляющих противомикробные и противовоспалительные свойства, которые нашли широкое применение в косметической промышленности и в производстве моющих средств.  Другим примером катализируемого липазами синтеза является получение гликозилглицеридов [33], используемых в качестве противоопухолевых средств, и эфиров алкилгликозидов и а-гидроксикислот [35], используемых в качестве натуральных компонентов косметических средств, значительно улучшающих эластичность кожи.

Получение производных а-гидроксикислот необходимо для предотвращения раздражения кожи, вызванного уменьшением значений рН, а также для лучшего проникновения в слои эпидермиса. Эфиры спиртов и короткоцепочечных кислот, являющиеся ароматизаторами и парфюмерными отдушками, также получают этерификацией спиртов, катализируемой липазами [30, 31]. Катализируемое липазами кинетическое разделение рацемических спиртов или сложных эфиров и асимметризация прохиральных мезополиолов или их эфиров являются удобными методами стереодивергентного синтеза хиральных биоактивных молекул, имеющих фармацевтическое применение [3]. Благодаря высокой селективности липаз, оказалось возможным получение оптически активных полимеров из рацемической смеси мономерных соединений [2]. Так, например, этерификацией различных моносахаридов винилакрилатом, катализируемой липазой, и последующей полимеризацией акрилового эфира, получают растворимые в воде полиакрилаты, способные сшиваться и образовывать нерастворимые в воде материалы с высокой водоадсорбирующей способностью [21]. 

В производстве биодизеля. Липазный катализ в производстве биодизеля призван избавить его от принципиального недостатка – большого количества щелочных отходов, снизить удельные затраты воды и энергии. В экономическом плане сегодня липазный катализ проигрывает щелочному, однако, в работе [33] показано, что при современных ценах на липазу, производство биодизеля рентабельно начиная от объемов от 200 тыс. т./год. Предположительная цена биодизеля, если не применять при его получении растворитель (в этом варианте технология нерентабельна), окажется равной 0,73–1,49 €/кг при текущей цене липазы, и 0,05–0,75 €/кг при прогнозируемой цене фермента в будущем. Стоит добавить, что цена ферментов, помимо увеличения масштабов производства, может быть снижена путем применения технологий рекомбинантных ДНК. Таким образом, ферментативный способ производства биодизеля при создании крупных производств и соответствующей экологической политике государства уже в ближайшем будущем сможет конкурировать со щелочным катализом.

В синтезе ароматических средств. В настоящее время исследователи во многих странах [7] стали уделять внимание ферментативному синтезу душистых веществ. Благодаря высокой каталитической активности и непревзойденной субстратной специфичности ферментов, их применение для синтеза душистых веществ может иметь высокую экономическую эффективность. Для этого наиболее часто используют свободные или иммобилизованные липолитические ферменты, проводя реакции в неводных средах.

Мицеллярные системы представляют собой универсальную микрогетерогенную среду для ферментативных реакций. Спонтанное образование мицелл идет в самых различных 212 органических растворителях, таких, как углеводороды (например, октан или бензол), высшие спирты, хлороформ, а также в их смесях. В качестве мицеллообразующего материала пригодны широко используемые в биохимии детергенты, например, додецилсульфат натрия, алкилированные полиэтиленгликоли (бридж, твин или тритон) или же природные фосфолипиды. Известны как нормальные мицеллы, существующие в воде (при не слишком большой концентрации органических добавок), так и обращенные мицеллы в органических растворителях при умеренном содержании воды. Ограничения, накладываемые на скорость ферментативной реакции диффузией субстрата и продукта, в микроэмульсиях практически отсутствуют из-за огромной удельной поверхности раздела между водными микрокаплями и органическим растворителем. Дополнительное преимущество таких систем состоит в том, что фермент, находящийся внутри микроэмульсионной капли, защищен от денатурирующего воздействия органического растворителя слоем молекул ПАВ. Имеются данные, свидетельствующие о возможности синтеза этиллаурата в среде гексана с помощью нанокатализаторов панкреатической липазы, с выходом эфира более 80%.

Таким образом, применение ферментных препаратов различной степени очистки позволяет не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но и дает возможность усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, наладить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т. д.

Заключение

В настоящее время накоплено достаточное количество информации о биологической роли и механизме катализа, для большинства видов липаз установлены особенности строения активного центра и некоторые свойства. Однако трудно найти достаточно полную информацию с точки зрения получения чистого препарата липазы, поэтому проблема глубокого изучения нативных препаратов липолитических ферментов, а также разработка научно-обоснованных подходов к их применению является актуальной в теоретическом и практическом отношении.  Недостаточно разработанной является методология применения не извлеченных ферментов в аналитических целях, для расширения определяемых показателей, в том числе, в определении токсичных элементов в растительном сырье, где присутствие токсичных элементов выступает одним из негативных факторов, оказывающих при попадании в организм человека и животных токсическое и мутагенное действие. Остаются актуальными вопросы, связанные с совершенствованием технологии получения ферментных препаратов растительного происхождения для аналитических целей.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Ашрефи Ф.Д., Касумова С.Ю., Агабекова Р.А. Препарат липазы Mucor racemosus и некоторые его свойства // Вестник Московского государственного областного университета. Сер. Естественные науки. 2010. № 2. С. 18-21.
2. Рекомбинантная термостабильная липаза из thermomyceslanuginosus: получение и биокаталитические свойства / А.Б. Беклемишев, Г.А. Коваленко, Л.В. Перминова, А.Л. Мамаев, М.Б. Пыхтина // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы VIII Московского Междунар. конгресса ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. М., 2015. С. 298-299.
3. Беленова А.С. Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой: дис. … канд. биол. наук. Воронеж, 2011.
4. Гамаюрова В.С., Шнайдер К.Л., Зиновьева М.Е. Жирно-кислотная специфичность липазы из дрожжей CandidaRugosa при модификации льняного и рапсового масел // Вестник Казанского технологического университета. 2014. № 24. С. 175-177.
5. Иммобилизация и стабилизация ферментных препаратов липаз / В.С. Гамаюрова, М.Е. Зиновьева, Е.В. Елизарова, К.Л. Васина // Вестник Казанского технологического университета. 2007. № 2. С. 103-108.
6. Гаскарова Е.Ф. Разработка технологии дрожжевой липазы для применения в пищевой промышленности: дис. ... канд. техн. наук. М., 2015. 215 с.
7. Грибков А.Н., Шипарева Д.Г. Липаза - фермент для сыра // Безопасность продукции и импортозамещение продуктов питания. М., 2015. С. 19-22.
8. Демченко Ю.А. Ингибирование активности липазы как биоаналитический сигнал для определения уровня содержания токсичных элементов в семенах подсолнечника и растительных маслах: дис. :.. канд. техн. наук. Воронеж, 2018. 189 с.
9. Зиновьева М.Е., Гамаюрова В.С., Шнайдер К.Л. Сравнение синтетазной активности двух видов липаз в неводных средах // Вестник Казанского технологического университета. 2011. № 6. С. 211-217.
10. Зубарева И.М., Митина Н.Б., Кириченко Е.С. Изучение липазной активности Blakeslea Trispora продуцента бета-каротина // Вопросы химии и химической технологии. 2012. № 1. С. 32-35.
11. Иммобилизация гидролитических ферментов на анионитах / О.М. Кожина, О.Д. Трофимова, О.П. Багно, А.С. Беленова // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8, № 6. С. 1035-1041.
12. Иммобилизация рекомбинантного штамма–продуцента термостабильной липазы из Thermomyces lanuginosus в наноуглерод-силикатные матрицы и свойства приготовленных биокатализаторов / Г.А. Коваленко, А.Б. Беклемишев, Л.В. Перминова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиологи. 2013. Т. 49, № 3. С. 1–11.
13. Идентификация каталитически активных групп липазы зародышей семян пшеницы (Triticum aestivum L.) / О.С. Корнеева, Т.Н. Попова, В.С. Капранчиков, Е.А. Мотина // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44, №. 4. С. 387-393.
14. Левчук А.Н., Войтович Е.Н., Лях В.А. Лектиновая активность кислой липазы семян льна масличного (LinumhumileMill.) // ВІСНИК. 2012. С. 33.
15. Ферментативный гидролиз липидов семян сортового и гибридного подсолнечника при хранении / В.Г. Лобанов, Т.П. Францева, Н.В. Ильчишина, А.И. Гаманченко // Известия ВУЗов. Пищевая технология. 2008. № 4. С. 10-14.
16. Мартемьянова Л.Е., Антипова Л.В. Применение ферментных препаратов в получении растительных белков // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2013. № 1 (55). С. 104-108.
17. Мирзоев А.М. Ферментативные процессы при хранении и переработке масличных семян в производстве растительных масел // ТТПС. 2015. № 2 (32). С. 31-36.
18. Мустафаев С.К., Шаззо А.А. Влияние физических методов воздействия на послеуборочное дозревание и ферментативную активность семян подсолнечника // Новые технологии. 2012.№1. С. 45-47.
19. Никитенко А.И., Леонтьев В.Н., Болтовский В.С. Липазы семян рапса // Труды БГУ. 2010. Т. 5, ч. 2. С. 40-43.
20. Никитенко А.И., Леонтьев В.Н., Болтовский В.С. Методические особенности определения активности липаз в семенах рапса // Труды БГТУ. Сер. Химия, технология органических веществ и биотехнология. 2011. Т. 1, №. 4. С. 190-193.
21. Останина Е.С. Технология переработки восковой моли, изучение противотуберкулезных свойств хитозана и взаимодействия с липолитическими ферментами: дис. ... канд. биол. наук. Щёлково, 2007. 142 с.
22. Разговоров П.Б., Кудрик. Е.В. Биосинтез ферментов и получение ферментных препаратов: учеб. пособие. Иваново, 2012. 123 с.
23. Липаза как один из факторов конкурентоспособности кондитерских изделий / Л.Е. Скокан, О.С. Руденко, М.В. Осипов, Н.Б. Кондратьев, Ф.И. Парашина // Кондитерское производство. 2015.№4. С. 19-21.
24. Смирнова Н.С. Оценка влияния микробиологических инкрустаторов на активность гидролитических процессов в семенах подсолнечника // Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2009. №16. С. 127-129.
25. Сравнительная характеристика липаз и перспективы разработки новых липолитических ферментных препаратов для пищевой промышленности / А.А. Толкачева, Е.С. Железняк, Д.А. Черенков, О.С. Корнеева // Актуальная биотехнология. 2016. № 3 (18). С. 177-178.
26. Шеламова С.А., Тырсин Ю.А. Роль карбоксильных групп в каталитической активности липазы i Rhizopus oryze1403 // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Естественные науки. 2014. Т. 26, №. 3 (174). С. 242-247.
27. Шеламова С.А., Тырсин Ю.А. Некоторые каталитические свойства липазы iRhizopusoryzae 1403 // Вестник ОГУ. 2009. № 6. С. 434-437.
28. Шеховцова Т.Н., Мугинова С.В., Веселова И.А. Развитие ферментативных методов // Химический анализ: на пути к совершенству / под ред. Ю.А. Золотова, В.М. Иванова, К.В. Осколока, А.Ф. Прохоровой. М.: УРСС, 2015. С. 245-257.
29. Шнайдер К.Л., Зиновьева М.Е., Гамаюрова В.С. // Получение липолитического ферментного препарата на основе дрожжей Yarrowia Lipolytica Y-3153 (АТСС 34088) // Перспективные биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов / под ред. акад. Л.В. Римаревой. М., 2014. С. 93-96.
30. Янышева Н.В. Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403: дис. ... канд. хим. наук. М., 2005. 203 c.
31. Ayten Sagiroglu. Conversion of Sunflower Oil to Biodiesel by Alcoholysis using Immobilized Lipase // Artificial Cells, Blood Substitutes, and Biotechnology. 2008. Vol. 36, Issue 2. P. 138-149.
32. Multifunctionality and diversity of GDSL esterase/lipase gene family in rice (Oryza sativa L. japonica) genome: new insights from bioinformatics analysis / H. Chepyshko, C.-P. Lai, L.-M. Huang, J.-H. Liu, J.-F. Shaw // BMC Genomics. 2012. Vol. 13. P. 309. DOI: 10.1186/1471-2164-13-309.
33. Effect of roasting and microwave pre-treatments of Nigella sativa L. seeds on lipase activity and the quality of the oil / Y. Mazaheri, M. Torbati, S. Azadmard-Damirchi, G.P. Savage // Food Chem. 2019. 15 Feb. Vol. 274. P. 480-486. DOI: 10.1016/j.foodchem.
34. Assessment of the Morphological, Biochemical, and Kinetic PropertiesCandida rugosa Lipase Immobilized on Hydrous Niobium Oxide to Be Used in the Biodiesel Synthesis / M. Miranda, D. Urioste, L.T. Andrade Souza, A.A. Mendes, H.F. de Castro // Enzyme Research. 2011. Article ID 216435. 10 pages. DOI:10.4061/2011/216435
35. Lipases: Sources, Production, Purification, and Applications / N. Patel, D. Rai, S. Shivam, S. Shahane, U. Mishra // Recent Pat. Biotechnol. 2018. 28 Oct. DOI: 10.2174/1872208312666181029093333
36. Ronkainen N.J., Halsall H.B., Heineman W.Electrochemical biosensors // Chemical Society Reviews. 2010. Т. 39, No 5. С. 1747-1763.
37. Smirnova D.V., Ugarova N.N. Bioanalytical systems based on bioluminesence resonance energy transfer using firefly luciferase // Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 2015. Vol. 18, No 10. P. 946-951. DOI: 10.2174/1386207318666150917095731
38. Design of biocompatible immobilized Candida rugosa lipase with potential application in food industry / Ivić J. Trbojević, D. Veličković, A. Dimitrijević, D. Bezbradica, V. Dragačević, M. Gavrović Jankulović, N. Milosavić // Journal of the Science of Food and Agriculture. 2016. Т. 96, No 12. С. 4281-4287.
39. Effects of monoacylglycerol lipase inhibitor URB602 on lung ischemia-reperfusion injury in mice / Y. Xiong, H. Yao, Y. Cheng, D. Gong, X. Liao, R. Wang // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2018. 23 Oct. Pii: S0006-291X(18)32254-X. DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.10.098. [Epub ahead of print].
40. Zhang X.F., Ai Y.H., Yu X.W. High-level expression of Aspergillus niger lipase in Pichia pastoris: Characterization and gastric digestion in vitro // Food Chem. 2019. 15 Feb. No 274. P. 305-313. DOI: 10.1016/j.foodchem.2018.09.020.
41. URL: http://sci.house/biotehnologiya_1270/lipoliticheskie-fermentyi-50565.html
42. URL: http://sci.house/biotehnologiya_1270/svoystva-lipaz-50566.html

___________________________________________________________________________________________

Демченко Юлия Александровна,старший преподаватель кафедры химии Адыгейского Государственного Университета, тел. 89284679097, e-mail:  Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. "> Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Demchenko Yulia Aleksandrovna, senior lecturer of chemistry department of  Adyghe State University, tel.89284679097, e-mail:  Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. "> Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.