ВМ14-220

УДК 577.15

Д93

 

Дьяченко Ю.А., Цикуниб А.Д.

ДЕЙСТВИЕ СОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

НА АКТИВНОСТЬ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ ЛИПАЗЫ IN VITRO

Аннотация. Установлено ингибирующее воздействие сорбиновой кислоты на панкреатическую липазу. Ингибирующая доза сорбиновой кислоты (ID50) для панкреатической липазы in vitro составила 0,24 ± 0,06%.   

Ключевые слова: сорбиновая кислота, панкреатическая липаза, ингибирующая доза (ID50)СК.

 

Dyachenko Y.A., Tsikunib A.D.

THE SORBIC ACID EFFECTS

ON ACTIVITY PANCREATIC LIPASE IN VITRO

Abstract. Installations an inhibitory effect of sorbic acid on pancreatic lipase. The inhibiting dose of sorbic acid (ID50) for pancreatic lipase in vitro was 0,24 ± 0,06%.

Keywords: sorbic acid, pancreatic lipase, inhibiting dose (ID50)SA

 

Изучение факторов, влияющих на ферментативный катализ, и раскрытие механизмов их эффекторного воздействия представляет существенный научный интерес в связи со значением ферментов в регуляции клеточного метаболизма.  Особенно актуальна данная проблема для пищеварительных ферментов, обеспечивающих адаптацию организма к различным экзогенным факторам, в том числе химическому составу пищи, так как, между разными химическими компонентами пищи в процессе пищеварения возникают взаимодействия, представляющие сложный комплекс полисубстратных процессов [1]. В настоящее время, биохимические аспекты пищеварения приобретают особую актуальность, в связи с резким, в эволюционном плане, и интенсивным, в количественном выражении, изменением химического состава пищи, и, в первую очередь, увеличением содержания в нем химических компонентов, искусственно добавляемых в процессе технологии их производства [2, 3, 4]. К таким широко применяемым в пищевой промышленности химическим соединениям относятся сорбиновая кислота (СК) и ее производные, такие как сорбаты натрия и калия, обладающие хорошим консервирующим и микробостатирующим действием [5, 6, 7]. СК - (2,4-гександиеновая кислота) природное соединение, впервые полученное из сока рябины, однако, в настоящее время, в пищевой промышленности применяют один из - транс-транс-к. изомеров СК, полученный химическим способом путем конденсации кетена CH2=C=O с кротоновым альдегидом CH3—CH=CH—CHO в присутствии кислотных катализаторов (например, трифторида бора), последующим гидролизом образующегося при этом лактона- 3-гидроксигексеновой кислоты и дегидратированием в СК [5, 8]. Большинство исследований [5, 7, 9] свидетельствует об относительной физиологической безопасности СК, однако, по данным некоторых авторов, она может вызывать аллергические реакции, а так же разрушать витамин В12 [3]. СК используется, преимущественно, при производстве кондитерских изделий, молочных и мясных продуктов, характеризующихся также высоким содержанием жира, что делает  актуальным, в условиях современной направленности питания, вопрос о влиянии консерванта на активность липолитических ферментов, и,  в первую очередь, липазы (триацилглицерол эфиргидролазы, К.Ф. 3.1.1.3), которая расщепляет сложноэфирные связи в молекулах триацилглицеролов с преимущественным образованием жирных кислот и моно-и диглицеридов. С другой стороны, в настоящее время, сама липаза находит широкое применение в пищевой промышленности, лечебной и диагностической медицине, в связи с чем, оптимизации биокаталитических характеристик фермента также уделяется особое внимание [10]. В связи с этим, целью наших исследований явилось изучение молекулярных механизмов влияния сорбиновой кислоты на активность панкреатической липазы и эффективность гидролиза нейтрального жира.           

 

Методы исследования

В основу определения активности липазы положен классический титриметрический метод [4, 11], с некоторыми модификациями. В качестве источника фермента использовали препарат ферментзаместительной терапии Панкреатин-ЛекТ, производства ОАО «Тюменский фармакологический завод», содержащий высокоочищенную липазу активностью не менее 3500 ЕД ФИП, а в качестве субстрата - нормализованное молоко с общим содержанием жира 6%. В модельные среды, состоящие из 5 мл субстрата, 1 мл фосфатного буфера с рН=8,7 и 1 мл раствора фермента (в разведении 1:25), добавляли по 5 мл свежеприготовленных в присутствии двууглекислого натрия растворов СК разных концентраций и получали опытные пробы с содержанием СК 0,05%, 0,1%, 0,2% и 0,4%. В качестве контроля выступила проба, не содержащая СК. При выборе концентрации СК мы исходили из того, что в пищевой промышленности она применяется в концентрациях от 30 до 300 грамм на 100 килограмм готового продукта, а допустимое суточное потребление для человека составляет 25 мг/кг [3, 5, 6, 7]. Пробы термостатировали при температуре 38-40 оС и через каждые 10 минут, не вынимая из термостата, отбирали параллельные пробы по 4 мл и немедленно оттитровывали 0,01н раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до устойчивого слабо-розового окрашивания. Концентрацию раствора щелочи проверяли титрованием 0,5 мл 0,1 н щавелевой кислоты. Расчет активности фермента проводили по формуле:

 

Formuls*50 мМ/л/ч,

 

где V1-V2- разность в объеме щелочи пошедшей на титрование опытного и контрольного растворов; Р - разведение фермента; T – коэффициент времени воздействия фермента (2 для 60 мин); V3 - объем фермента; V4 - объем щелочи, пошедшей на титрование 0,5 мл 0,1н раствора щавелевой кислоты.

Статистической обработке подвергали результаты пяти серий экспериментов.

 

Результаты исследования и их обсуждение

Из полученных данных видно, что СК снижает активность панкреатической липазы и приводит к уменьшению как скорости, так и глубины гидролиза нейтрального жира, причем эффект ингибирующего действия проявляется во всех исследованных концентрациях СК, но с разной интенсивностью (рисунок 1)

** р≤0,01, * р≤0,05 – достоверность различий с контролем

Рис. 1- Динамика изменения активности липазы под действием различных концентраций сорбиновой кислоты

Так, при концентрации СК в модельной среде в 0,05% достоверные различия активности фермента с контролем выявляются только к 50 мин экспозиции, а при концентрациях СК в 0,1% и 0,2% активность панкреатической липазы в сравнении с контролем начинает достоверно (р <0,05) снижаться уже с 20 мин экспозиции и достигает максимальных различий (р <0,01) к 40-50 мин. В концентрации 0,4% СК снижает активность панкреатической липазы (р <0,01) уже в течение первых 10 мин экспозиции, а к 50 минутам ферментативная активность в сравнении с контролем снижается в 19,5 раза.

Ингибирующая доза СК (ID50) для панкреатической липазы in vitro, вызывающая снижение ферментативной активности в два раза, составила 0,24 ± 0,06%.

Корреляционный анализ выявил обратные зависимости между концентрацией и временем воздействия СК, с одной стороны, и активностью панкреатической липазы - с другой, то есть, чем больше концентрация и длительнее действие СК, тем меньше активность фермента в сравнении с контролем. При этом наиболее тесные корреляционные зависимости выявляются между активностью фермента и концентрацией СК при воздействии в течение 40 и 50 мин (r = - 0,84 и r = - 0,90 соответственно), а также активностью фермента и временем действия СК при концентрациях СК 0,1% (r = - 0,75) и 0,2% (r = - 0,80).

Данные о химическом строении СК позволяют предположить, что, являясь по своей природе одноосновной ненасыщенной карбоновой кислотой алифатического ряда [5], она ингибирует липазу по принципу конкурентного ингибирования, в пользу которого свидетельствуют также данные ряда авторов [10, 15] о том, что непредельные жирные кислоты сильнее подавляют активность панкреатической липазы. 

Таким образом, результаты исследований позволили установить, что сорбиновая кислота способна оказывать ингибирующее воздействие на панкреатическую липазу.

 

Примечания

 

  1. 1.Уголев A.M. Иезуитова Н.Н., Тимофеева Н.М. Энзиматический барьер тонкой кишки // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. СПб., 1992. № 8. С. 1-20.
  2. 2.Батурин А.К., Мендельсон Г.И. Питание и здоровье: проблемы XXI века // Пищевая промышленность. 2005. № 5. С. 38-40.
  3. 3.Нечаев А.П., Кочеткова А.А., Зайцев А.Н. Пищевые добавки. М., 1997. 257 с.
  4. 4.Хвостова Т.С. Сравнительная биохимическая характеристика патентованных препаратов ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии: дис. … канд. биол. наук. Краснодар, 2003.
  5. 5.Овчарова Т. П., Засосов В.А., Бабичева О.Н. Применение сорбиновой кислоты в пищевой промышленности. М., 1960. 120 с.
  6. 6.Стекольников Л.И., Горбатов В.М. Современные способы удлинения сроков хранения мяса с помощью химических консервантов // Обзорная информация / ЦНИИТЭИ мясомолпром. М., 1984. С. 3-14.
  7. 7.Schmid R., Verger R. Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. № 37. Р. 1608-1633.
  8. 8.Люк Э., Ягер М. Консерванты в пищевой промышленности. СПб., 2000. 255 с.
  9. 9.Полянский Н.Г. () Химия сорбиновой кислоты // Химическая промышленность. 1963. № 1. С. 20-25.
  10. 10.Павленко И.М. Липазы в системе обращенных мицелл: роль межфазной поверхности в регуляции липолитической активности ферментов: дис. … канд. хим. наук. М., 2005.
  11. 11.Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии. 2-е изд. Минск: Высш. шк., 1976. 190 с.

________________________________________________________________________________

Дьяченко Юлия Александровна, аспирант кафедры ботаники факультета естествознания Адыгейского государственного университета, эксперт-биохимик лаборатории нутрициологии и экологии НИИ комплексных проблем АГУ, тел.89284679097, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Цикуниб Аминет Джахфаровна, доктор биологических наук, профессор кафедры химии факультета естествознания Адыгейского государственного университета, директор НИИ комплексных проблем АГУ, тел. 8928461725, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. .

Яндекс.Метрика
© Адыгейский государственный университет. НИИ комплексных проблем.