УДК 543.544.5.068.7
ББК 24.46

Цикуниб А. Д.
Дзыбов Р. М.
Лаборатория нутрициологии и экологии НИИ комплексных проблем АГУ

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АФЛАТОКСИНА B1 В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

     Аннотация: на основании анализа отечественной и зарубежной литературы даны современные представления о строении, физико-химических свойствах и методах определения афлатоксина B1 в пищевых продуктах.
    Ключевые слова: афлатоксин В1, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), масс-спектрометрия (МС).

Tsikunib A. D.
Dzybov R. M.
Nutrition and Environment Laboratory, of Scientific Research Institute of complex Problеms of Adyghe State University

MODERN METHODS for the DETERMINATION of AFLATOXIN B1 IN FOOD

    Abstract: on the basis of analysis domestic and foreign literature the modern views on the structure, physico-chemical properties and methods of determination of aflatoxin B1 in food products.
    Key words: aflatoxin B1, high performance liquid chromatography (HPLC), thin layer chromatography (TLC), mass spectrometry (MS).

    Наиболее опасным и часто встречающимся в продуктах питания токсичным веществом является афлатоксин В1 – вторичный метаболит микроскопических плесневелых грибов рода Aspergillus Flavus и Aspergillus Parasiticus [1]. Он плохо растворяется в воде, но хорошо в менее полярных растворителях, таких как метанол, диметилсульфоксид, хлороформ. Соединение в растворе стабильное, однако в химически чистом виде относительно неустойчивое и чувствительное к действию воздуха и света, особенно к УФ-излучению [14]. При детектировании в УФ свете флуоресцирует сине-голубым цветом [2]. Строение и физико-химические свойства афлатоксина B1 представлены на таблице 1.

Таблица 1. Строение и физико-химические свойства афлатоксина B1.

	Химическая формула	C17H12O6
Строение афлатоксина B1 было установлено в 1967 году, а в 1969 году подтверждено лабораторным синтезом [8]	Молярная масса	312,2798 г/моль
	Температура плавления.	269 °C
	Растворимость в воде	10-20 мкг/мл
	λ макс, нм	265,362
	Агрегатное состояние	бесцветный или светло-желтый кристаллический порошок

   Афлатоксин B1 обладает сильнейшей гепатотоксичностью и гепатоканцерогенной активностью [20]. При воздействии афлатоксина B1 на организм, он гидроксилируется до эпоксида, который воздействует на ДНК печени [18] и вызывает рак печени [20].
   Предотвратить загрязнение продуктов питания афлатоксинами практически невозможно, поэтому необходим строгий контроль данных веществ в пищевых продуктах растительного и животного происхождения [9]. Предельно допустимые концентрации афлатоксина B1 [6] регламентируются в продовольственном сырье и пищевых продуктах растительного происхождения: в России – 0,005 мг/кг, Германии – 0,01, США – до 0,02 мг/кг [7].
   Для определения афлатоксина В1 в продуктах питания применяют в основном хроматографические методы [20]. Общая схема методов определения афлатоксина B1 представлена на рис. 1.

Рис. 1. Общая схема методов определения афлатоксина B1.

   Описаны методы выявления и определения содержания афлатоксина В1 тонкослойной хроматографией (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектированием, основанные на экстракции из зерновых, зернобобовых, орехов, кондитерских изделий, хлебопродуктов и концентратов, плодовых и овощных консервов 10 % раствором хлорида натрия и ацетоном; из какао-бобов, какао-порошка и шоколада гексаном и раствором азотнокислого серебра-хлороформа (1:5); из растительных масел и животных жиров раствором гексана, 4 % раствором хлорида натрия и ацетонитрила (1:5:10); из молочных продуктов раствором хлорида натрия, лимонной кислоты и хлороформа (10:1,2:5). Диапазон измеряемых содержаний афлатоксина B1 во всех продуктах 0,003-0,02 мг/кг [2].
   Наиболее быстрый, дешевый, весьма эффективный, надежный и безопасный процесс выделения и очистки афлатоксина из пробы – метод QuEChERS – (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), основанный на извлечении афлатоксинов из пробы смесью ацетонитрил-вода и добавлении буферирующих неорганических солей. В результате такой экстракции афлатоксины переходят в органическую фазу, а более полярные примеси – в водный слой. Примеси (некоторые сахара и жирные кислоты), оставшиеся в ацетонитриле, могут быть удалены на дисперсионном сорбенте, содержащем амины (PSA сорбент) [11].
   Для совместного определения афлатоксина В1, зеараленона, Т-2 токсина и дезоксиниваленола, содержащихся в одних и тех же продуктах, предложено использовать смесь ацетонитрила и раствора хлорида калия с массовой долей 4% в соотношении 9:1 [3].
   При разделении афлатоксина на хроматографических пластинках «Силуфол» с силикагелевым покрытием хроматографирование проводилось смесью растворителей гексан-ацетон (1:1). При этом величина Rf для афлатоксина В1 – 0,45. В отдельных случаях предложено использование подтверждающего теста водным раствором азотной кислоты, при этом флуоресценция меняется с оттенков голубого и синего на ярко-желтую. Такой подход позволил ускорить выдачу результата и экономно расходовать реактивы и хроматографические пластинки [5].
   Описан метод определения афлатоксина B1 с помощью ТСХ, когда на пластинку наносят 5 мкл основного раствора и 5 мкл стандартного раствора смеси афлатоксинов. Сначала пластинку помещают в камеру, насыщенную парами системы толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота (5:4:1), затем хлороформ-метанол (99:1). Пластинку просматривают в УФ-лучах (365 нм). Rf афлатоксина B1 равно 0,39. Вместо системы хлороформ-метанол (99:1) можно использовать систему четыреххлористый углерод-ацетон-уксусная кислота (20:10:1). Rf афлатоксина B1 в этом варианте будет 0,38 [6]. Обобщенные данные об Rf афлатоксина B1 в разных системах растворителей приведены в таблице 2.

Таблица 2. Обобщенные данные об Rf афлатоксина B1 в разных системах растворителей.

   Для подтверждения присутствия афлатоксина на пластинке, ее обрабатывают парами йода. Если при этом не произошло гашения флуоресценции пятен, пластинку опрыскивают йодом и раствором серной кислоты и рассматривают ее под ультрафиолетом. Изменение окраски пятен свидетельствует о наличии афлатоксина. Затем можно провести полуколичественное определение по минимально детектируемым веществам: на пластинку наносится ряд пятен возрастающего объема из исходного экстракта (1, 3, 5,7 и 9 мкл) и пятна стандарта (2-3 мкл) [8].

  Для определения афлатоксинов обычно используют обращенно-фазовую ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. Применяют колонки, заполненные сорбентом из силикагеля с привитыми алкильными группами С18 и С8. В качестве подвижной фазы используют смеси воды с метанолом или ацетонитрилом [11]. Так, с применением данного метода возможно определение афлатоксинов В1 в зерновых, фруктах, орехах. Афлатоксин экстрагируют метанолом, затем очищают экстракт на иммуноаффинных колонках. В качестве подвижной фазы применяют смесь метанол-вода-ацетонитрил (9:32:9). Детектируют при 440 нм, предел обнаружения составляет 0.1 мкг/кг.
   Для более достоверной идентификации, афлатоксин B1 определяют после предварительного перевода его в производное. Перевод основан на насыщении двойных связей в фурановом кольце. Переводят афлатоксин в производные до разделения на колонке реакцией с трифторуксусной кислотой (ТФУК) или после разделения на колонке реакцией с йодом или бромом [10]. Использование ТФУК основано на переводе афлатоксина В1 в производное В2а, который по сравнению с первым интенсивно флуоресцирует. Реакция дериватизации в зависимости от способа приготовления производных может протекать с разной скоростью. Для определения токсинов в арахисе, орехах, семенах тыквы, кукурузы и в арахисовом масле [19] применяют предколоночную дериватизацию с ТФУК, в качестве подвижной фазы используют смесь вода-ацетонитрил-метанол (70:17:17). Проводят флуоресцентное детектирование с длинами волн возбуждения и детектирования 360 и 440 нм соответственно. Предел обнаружения составляет 0.3 мкг/кг [13].
   Чаще афлатоксин B1 переводят в производное после хроматографического разделения [14]. Получение таких производных возможно при наличии второго изократического насоса. Производные, полученные при взаимодействии афлатоксинов с йодом, детектируются с наивысшей чувствительностью. Раствор йода вводят в поток выходящего элюента, далее смесь прокачивают через катушку из нержавеющей стали, где поддерживается высокая температура (75°С) для протекания реакции, и уже далее образовавшийся продукт регистрируют флуориметрическим детектором.
Разработана методика определения афлатоксинов с переводом их в йод-производные. Разделение проводили на колонке Spherisorb ODS с использованием подвижной фазы вода-ацетонитрил-метанол (60:30:10) и длины волн возбуждения и детектирования 365 и 440 нм соответственно [18]. Аналогично определяют афлатоксины при анализе кукурузы, арахисового масла, сорго и солода. Афлатоксин В1 бромируют добавлением гидробромидапиридиния или электрохимически генерированного брома введением в подвижную фазу KBr и HNO3.
Разработана методика определения афлатоксина B1 в различных специях [12]. Для извлечения микотоксинов применяли смесь метанола и воды, очищали экстракты на иммуноаффинных колонках. Проводили постколоночную дериватизацию c гидробромидпиридином. В качестве подвижной фазы применяли 40%-ную смесь (5:4) метанол-ацетонитрил и воду. Разделение проводили на колонке Spherisorb ОDS2 при длинах волн возбуждения 362 нм и детектирования 418 нм. Пределы обнаружения токсинов составили 0,06 мкг/кг.
   Разработан метод определения афлатоксинов для хлебных злаков с применением постколоночной фотохимической дериватизации. Афлатоксин B1 извлекали смесью метанола и фосфатного буферного раствора, очищали твердофазной микроэкстракцией. В качестве подвижной фазы применяли смесь вода-ацетонитрил-метанол (54:38:8), колонку с адсорбентом C18 при длинах волн возбуждения и детектирования 366 и 440 нм. Пределы обнаружения составили 0,035–0,2 мкг/кг [16, 17].
Разработан метод определения афлатоксина B1 в зерновых культурах, орехах и продуктах переработки с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, с очисткой на иммуноаффинной колонке и послеколоночной дериватизацией. Предел количественного определения афлатоксина В1 – 8 мкг/кг. Метод применим в отношении кукурузы с содержанием 24,5 мкг/кг, арахисового масла с содержанием 8,4 мкг/кг и сырых арахисовых орехов с содержанием 16 мкг/кг общей суммы афлатоксинов [9]. Метод может использоваться для масличных культур, сушеных фруктов и продуктов их переработки, и основан на экстрагировании пробы смесью метанола и воды, ввода его в колонку для аффинной хроматографии, содержащую антитела. Пробу отделяют от антител при помощи метанола. Афлатоксины определяют количественно при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой с определением флуоресценции и послеколоночной дериватизацией [15].
  Разработан метод идентификации афлатоксина B1 методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноклональных антител (МкАт), однако он не обладает высокой специфичностью, так как наблюдается высокая перекрестная активность МкАт-4 с афлатоксинами B1, B2 и G1. Это позволяет предложить МкАт в качестве реагента для группового определения афлатоксинов B и G ряда. Отмечено также незначительное перекрестное взаимодействие МкАт с афлатоксином G2 (2,5%-4,5%) [11].
   Благодаря быстрому росту технологических и научных знаний, в современном мире стали возможны быстрые и одновременно чувствительные методы обнаружения афлатоксинов в пищевых продуктах, которые используются для контроля качества продуктов питания и кормов, а также обеспечения здоровья человека. Самым популярным и чувствительным методом по обнаружению афлатоксина B1 является ВЭЖХ, однако, в силу дороговизны оборудования и реактивов. Актуальными остаются методы ТСХ проверенные временем и менее затратные.

Примечания:

1. Другов Ю.С., Родин А.А. Анализ загрязненных биосред и пищевых продуктов. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. 294 с.
2. ГОСТ 30711-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения содержания афлатоксинов В(1) и М(1).
3. ГОСТ 31748-2012 (ISO 16050:2003) Продукты пищевые. Определение афлатоксина B(1) и общего содержания афлатоксинов B(1), B(2), G(1) и G(2) в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (с поправками).
4. Буркин М.А., Яковлева И.В., Свиридов В.В. Определение афлатоксина B ИФА с использованием моноклональных антител // Успехи медицинской микологии. 2003. № 1. С. 127-130.
5. Мокшина Н.Я., Селеменев В.Ф., Скопинцева В.Л. Определение микотоксинов в пищевых продуктах методом ТСХ // Сорбционные и хроматографические процессы. 2005. Т. 5, вып. 2. С. 254.
6. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: справочник / И.П. Кондрахин, А.В. Архипов, В.И. Левченко [и др.]; под ред. В.Н. Сайтаниди. М.: Колос, 2004. 520 c.
7. СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов: санитарно-эпидемиологические правила и нормы. – М.: Академия, 2002.
8. Цикуниб А.Д. Устойчивость семян рапса к токсигенной микрофлоре и разработка рекомендаций по улучшению биологической ценности получаемых продуктов: дис. … канд. техн. наук. М., 1992.
9. Амелин В.Г., Карасева Н.М., Третьяков А.В. Хроматографические методы определения микотоксинов в пищевых продуктах // Журнал аналитической химии. 2013. Т. 68, № 3. С. 212–223.
10. Abdulkadar A.H.W., Abdulla A.Al. Ali, Afrah M.Al. Mycotoxins in food products available in Qatar // Food Control. 2004. Vol. 15. P. 543.
11. Immunoaffinity Column Cleanup with Liquid Chromatography for Determination of Aflftoxin B 1 in Corn Samples: Interlaboratory Study / C. Brera, F. Debegnach, V. Minardi [et al.] // J. AOAC Int. 2007. Vol. 90, № 3. P. 765.
12. Garner R.C., Whattam M.M., Taylor P.J.L., Stow M.W. Analysis of United Kingdom purchased spices for aflatoxins using immunoaffinity column clean up procedure followed up by high-performance liquid chromatographic analysis and post-column derivatization with pyridium bromide perbromide // J. Chromatogr. 1993. Vol. 648. P. 485.
13. Guevara Gonzаlez R.G. Aflatoxins – Biochemistry and Molecular biology. Сroatia: InTech, 2011. Р. 439.
14. Glutathione-S-transferase A3 knockout mice are sensitive to acute cytotoxic and genotoxic effects of aflatoxin B 1 / Z. Ilic, D. Crawford [et al.] // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010. Vol. 242. P. 241–246.
15. Liquid Chromatography for the Determination of Mycotoxins in Foods / R. Romero-González, A. Garrido Frenich, J.L. Martínez Vidal [et al.] // J. Сhromatogr. 2011. Vol. 1218. P. 1477.
16. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection
/ M. Quinto, G. Spadaccino, C. Palermo, D. Centonze // J. Chromatogr. A. 2009. Vol. 1216. P. 8636.
17. Tarter E.J., Hanchay J.P., Scott P.M. Improved liquid chromatographic method for determination of aflatoxins in peanut butter and other commodities // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1984. Vol. 67. P. 597.
18. Environmental and chemical carcinogenesis / G. Wogan, S. Hecht, J. Felton, A. Conney, L. Loeb // Seminars in Cancer Biology. 2004. Vol. 14. P. 473-486.
19. Simultaneous determination of pesticide residues, mycotoxins and plant toxins in soya meal samples employing UHPLC-MS / M. Zachariasova, J. Hajslova, M. Kostelanska [et al.] // Anal.Сhim. Аcta. 2008. V. 625. P. 77.
20. Human skin penetration of selected model mycotoxins // Toxicology. Vol. 301 (1-3). P. 21–32. DOI:10.1016/ j.tox.2012.06.012. PMID 22749975.

__________________________________________________________________________________________________________________________________

Цикуниб Аминет Джахфаровна, доктор биологических наук, профессор, директор НИИ комплексных проблем АГУ, зав. лабораторией нутрициологии и экологии, 385000, г. Майкоп, ул. Гагарина, 13, 8928461725, Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. .
Tsikunib Aminet Dzhakhfarovna, Head of Nutrition and Environment Laboratory, Director of Scientific Research Institute of complex Problems of Adyghe State University
Дзыбов Руслан Муратович, магистрант, тел. +79384587911, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.
Dzybov Ruslan Muratovich, graduate student, tel. +79384587911, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.